什么是PCR？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于體外擴(kuò)增特定的DNA片段。

PCR技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

PCR之父 Kary Mullis

PCR反應(yīng)基本原理和反應(yīng)過(guò)程

基本原理：

反應(yīng)過(guò)程：

變性——將被復(fù)制的DNA片段在高于其Tm的條件下（94~95℃）加熱，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂二解螺旋，形成兩條單鏈分子作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，以便與引物結(jié)合。

退火——將反應(yīng)體系的溫度降至寡核苷酸（引物）的熔點(diǎn)溫度以下（40~70℃），以便使引物能與模板DNA序列互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈。

延伸——將反應(yīng)體系的溫度升至72℃左右，此時(shí)反應(yīng)體系按照模板鏈的序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)原則以此把dNTP加至引物的3’端，在Taq DNA聚合酶的存在下，雜交鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈。

以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)

● 逆轉(zhuǎn)錄PCR

提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

● 巢式PCR

對(duì)靶基因進(jìn)行二次擴(kuò)增，第二次擴(kuò)增所用的模板為第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物。

● 多重PCR

在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中同一靶基因多個(gè)不同序列的片段或多個(gè)不同靶基因的片段。

● 單細(xì)胞PCR

單細(xì)胞PCR技術(shù)建立于1991年，研究者用膜片鉗技術(shù)成功地從單個(gè)細(xì)胞中獲取了細(xì)胞質(zhì)，并以此為材料進(jìn)行了RT-PCR用于神經(jīng)例子通道的研究。

● PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變

在PCR產(chǎn)物一端引入點(diǎn)突變，只需一對(duì)引物進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增：用一條帶有限制性酶切位點(diǎn)（位點(diǎn)A）和預(yù)期突變的誘變引物（P1）和一條帶有另一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)（位點(diǎn)B）的野生序列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由此獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的P1端便帶有突變點(diǎn)。

● 原位PCR

直接法：使用標(biāo)記（放射性同位素、生物素、地高辛、熒光素等）的引物或脫氧三磷酸核苷酸（如dUTP）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則標(biāo)記物摻入到PCR產(chǎn)物中。最后用放射自顯影、免疫組化或熒光法檢測(cè) PCR產(chǎn)物及其在細(xì)胞內(nèi)位置。

間接法：先進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)DNA的原位擴(kuò)增，然后用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行原位雜交。

● 熒光定量PCR

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。qPCR已經(jīng)成為目前臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室接受程度最高的技術(shù)，在各類病毒、細(xì)菌等病原微生物的鑒定和基因定量檢測(cè)、基因多態(tài)性分型、基因突變篩查、基因表達(dá)水平監(jiān)控等多種臨床實(shí)踐中得到大量應(yīng)用。

● 數(shù)字PCR

通過(guò)將一個(gè)反應(yīng)體系分成幾千到數(shù)萬(wàn)個(gè)反應(yīng)單元，并盡可能讓每個(gè)單元包含一個(gè)拷貝靶分子，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，是一種檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行絕對(duì)定量的qPCR反應(yīng)，而非以模板CT值進(jìn)行核酸定量的real-timePCR，該技術(shù)具有超高的靈敏度與精密度。這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面呈現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

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